本局設九個業務單位，分別為：永華文化中心管理科（負責管理臺南文化中心、歸仁文化中心、台江文化中心與新化演藝廳）、民治文化中心管理科（負責管理新營文化中心、永成戲院、吳晉淮音樂紀念館）、文化園區管理科（負責管理蕭壠文化園區、總爺藝文中心與水交社文化園區）、藝術發展科、文化建設科、文化資源科、古蹟營運科、文化研究科（負責管理葉石濤文學紀念館、臺南左鎮化石園區及王育德紀念館）、文創發展科（負責管理愛國婦人館及藍晒圖文創園區）；另設秘書室、人事室、會計室與政風室四個輔助單位。此外，下轄臺南市立圖書館及臺南市文化資產管理處，二個附屬機關。